Kutatás
Mechanoelektromos jelátvitel a szőrsejtekben
Elektromechanikus jelátvitel a külső szőrsejtekben
Mechanoelektromos jelátvitel a szőrsejtekben
A cochlearis folyadékterek hangingerek által kiváltott vibrációját a sztereociliumokban elhelyezkedő mechanoszenzitív ioncsatornák alakítják át elektromos árammá. Ezen csatornák „kapuzását” (azaz nyitását és záródását) a sztereociliumok dőlése szabályozza. A „kapuzás” pontos részletei a mai napig nem ismertek, bár valószínűleg egy tisztán mechanikai jelenségről van szó, amit a folyamat elképesztően nagy sebessége valószínűsít (denevérekben 200 kHz, emberben „csupán” 20 kHz). Ismert, hogy a kapuzó mechanizmus összefüggésben van egy különösen vékony, kb. 6 nm átmérőjű, az egyes szeteociliumokat összekötő, extracelluláris filamenttel, az úgynevezett „tip link”-kel. A „tip link” károsodása (pl. túlzottan nagy intenzitású hangingerek alkalmazása során bekövetkező kórosan erőteljes stimulációt követően) süketséget okoz.
Munkacsoportunk a mechanoelektromos jelátvitelt vizsgálja, amelynek során a patch-clamp technika teljes sejtes-konfigurációjával történő ionárammérést, valamint ezzel párhuzamosan a kettős-foton konfokális mikroszkópiával történő intracelluláris kalciumkoncentráció-meghatározást végzünk. Megmutattuk, hogy a „tip link”-ek enzimatikus vagy nem enzimatikus módon történő roncsolása után a csatornák nyitott állapotba kerülnek, ami egy "tónusos" áram kialakulását eredményezi (Meyer és mtsai., 1998). Nemrégiben azt is bizonyítottuk, hogy ez a tónusos áram mechanoszenzitív és a kapuzó mechanizmusa kalciumfüggést mutat (Meyer és mtsai., 2005). Ezek az eredmények egy intracellulárisan elhelyezkedő és kalciumfüggést mutató elasztikus kapuzó mechanizmus jelenlétét bizonyítják.
Elektromechanikus jelátvitel a külső szőrsejtekben
A külső szőrsejt (outer hair cell - OHC) membránpotenciáljának változása mechanikai erővé alakul, ami a sejttest összehúzódását és megnyúlását okozza. Számos kutató szerint ez az elektromosság által kiváltott mozgás (ún. elektromotilitás) az alapja a cochlea különleges frekvenciaszelektivitásáért, érzékenységéért és széles dinamikai tartományáért. Úgy gondolják, hogy a sejtek által kiváltott elektromechanikus erő ellensúlyozza a cochleában fellépő, a folyadék és a sejtek mozgásából származó csillapítást, és ezáltal biztosítja a cochlea egyedülálló mechanikai hangoltságát. A szomatikus elektromotilitásért felelős „motor molekulát” Peter Dallos munkacsoportja klónozta. Ez, a prestinnek elnevezett molekula az „iontranszporter 26” géncsaládba tartozik, amely család aniontranszportereket és ezekkel rokon fehérjéket kódol. Legalább 6000 ilyen molekula található a szőrsejtek felszíni membránjának minden mm2-én. Az még a mai napig nem ismert, hogy ezen molekulák mozgása hogyan kapcsolódik a citoszkeletonhoz és hogyan jön létre a szomatikus elektromotilitás. Hasonlóan a sztereociliumokban zajló eletromechanikus transzdukcióhoz, ennek a mechanizmusnak is elképesztően gyorsnak kell lennie, hiszen az ultraszonikus frekvenciatartományban is megfelelően kell működnie. Az előbbiekben vázolt transzdukciós mechanizmus károsodása süketséget okoz.
Munkacsoportunk az elektromechanikai transzdukció mechanizmusát tanulmányozza lézer Doppler-vibrométer és az atomerő spektroszkópia együttes alkalmazásával. A vibrométer alkalmazásával kimutattuk, hogy a szomatikus elektromotilitás a membránpotenciál változását ciklusról-ciklusra, legalább 100 kHz-ig követni képes (Frank és mtsai., 1999). Ezen eredmény alapján megállapítottuk, hogy a külső szőrsejt sejttestje rendelkezik azon molekuláris „gépezettel”, ami csupán kismértékű csillapítással és késleltetéssel képes jóval a hallásküszöb felső határát meghaladó frekveciájú elektromechanikus válasz kialakítására. Azóta kifejlesztettünk egy olyan új eljárást, amellyel biológiai struktúrák mechanikai tulajdonságai tanulmányozhatók akár 40 kHz-ig (Scherer és mtsai., 2000; Scherer és Gummer, 2004a).
A módszer egy atomerő mikroszkópiás miniatűr tűt ("cantilever") alkalmaz, és a hallásbiológiai kutatásokon kívül is használható. A módszer különösen előnyös oldatban elhelyezkedő biológiai minták tanulmányozására. Ezen módszer felhasználásával a cochleában lévő sejtek és membránstruktúrák biológiai és mechanikai tulajdonságait vizsgáljuk.
A cochlea nagy érzékenysége, frekvenciaszelektivitása és széles dinamikai tartományt átfogó képessége csupán mechanikai erősítés segítségével valósítható meg. Az erősítő mechanizmussal kapcsolatosan két különböző nézet is létezik. Mindkét hipotézis azon alapszik, hogy az erőt az elektromechanikus transzdukció állítja elő a külső szőrsejtben. Az egyik elképzelés szerint azonban a transzdukció a sejt szómájában történik, míg a másik szerint a sztereociliumokban. A szóma hipotézis másik elképzeléssel szembeni előnye az, hogy (amint az ismeretes) a külső szőrsejt a teljes, funkcionálisan lényeges frekvenciatartományban képes az elektromotilitásra (Frank és mtsai., 1999). Ennek az elképzelésnek a hátránya ugyanakkor, hogy a receptorpotenciált (ami a szomatikus elektromotilitás hajtóereje) a basolaterális sejtmembrán impedanciája szűri (low-pass filtering, Preyer és mtsai, 1996). Az említett mechanizmus azonban a receptorpotenciálnak a sztereociliumok elmozdulásához képesti olyan mértékű csillapítását és késleltetését eredményezi, hogy a szomatikus elektromotilitás önmagában biztosan nem tehető felelőssé a cochlearis erősítés mechanizmusáért. A második elképzelésnek vagyis annak, hogy a nagyfrekvenciás elektromechanikai transzdukció a sztereociliumokban játszódik le, megvan az az előnye, hogy ebben az esetben a sztereociliumok mebránja nem viselkedik alul áteresztő szűrőként, ám hátrányára válik, hogy a mai napig nem létezik közvetlen bizonyíték arra vonatkozólag, hogy magas frekvenciákon a sztereociliumok elektromotilitással rendelkeznének. Megjegyzendő ugyanakkor, hogy Robert Fettiplace munkacsoportjának van kísérletes bizonyítéka arra, hogy a külső szőrsejtek sztereociliumai tartalmaznak elektromechanikus jelátalakítókat. A kérdés, azonban, hogy az itt létrejövő transzdukció megfelelően magas frekvenciákon is működőképes-e és vajon képes-e elegendően nagy erőt a Corti-szervbe juttatni, továbbra is megválaszolandó.
Munkacsoportunk a külső szőrsejtek cochlearis erősítésben betöltött szerepét vizsgálja. Három dimenziós vibrációs méréseket végezve arra az eredményre jutottunk, hogy a membrana tectoria sugár irányú rezonanciára képes (Gummer és mtsai., 1996; Hemmert és mtsai., 2000a). Véleményünk szerint a rezonanciamozgás időbeli tulajdonságai lehetőséget adnak a külső szőrsejt basolateralis membránjának elektromos impedanciája által kiváltott szomatikus elektromechanikai erő okozta késleltetés kompenzációjára. Ezek a kísérletek adták az első ötletet arra vonatkozólag, hogy az elektromechanikai erő milyen módon tevődhet át a Corti-szervre, hogy ezáltal létrehozza a cochlearis erősítést. Mivel magas frekvenciákon a Corti-szerv csillapítása és tehetetlensége szintén kiválthatja az elektromechanikai erő jelentékeny csökkenését és késleltetését, meghatároztuk a Corti-szerv mechanikai impedanciáját is (Scherer és Gummer, 2004a). Azt találtuk, hogy pontszerű terhelést követően a Corti-szerv tisztán viszkoelasztikus anyagként viselkedik, valamennyi fiziológiailag fontos ingerlési frekvencián, azaz a rendszerben nem található tehetetlenségi komponens. Összekapcsolva az impedanciaméréseket a Corti-szerv sebességének meghatározásával (a cochleán belüli elektromos stimulációt követően) megállapítottuk, hogy a lamina reticularisra kifejtett elektromechanikai erőnek széles rezonanciamaximuma van (Scherer és Gummer, 2004b). Úgy gondoljuk, hogy a külső szőrsejtek piezoelektromos rezonanciája, ahogyan azt Bill Brownell és munkatársai is felvetették, lehet a felelős az erő széles rezonanciamaximumáért. Elképzelhető, hogy ez a rezonancia kompenzálhatja a külső szőrsejt basolaterális membránjának elektromos impedanciájából adódó amplitúdócsillapítást. Jelenleg azon dolgozunk, hogy meghatározzuk az elektromechanikai erő és a sztereociliumok közötti kapcsolatot a belső szőrsejtekben.
Bár számos audiológiai teszt létezik a halláskárosodások differenciáldiagnózisára, még mindig nincs lehetőségünk arra, hogy meghatározzuk a humán cochleában esetlegesen jelenlévő mechanikai hibák pontos helyét. Ez főként abból fakad, hogy az emberben a belsőfül a halántékcsontba ágyazott, aminek következtében a közvetlen orvosi vizsgálatok szempontjából megközelíthetetlen. A cochlearis erősítésből származó halláskárosodás egyetlen klinikai jele az otoakusztikus emisszió hiánya. Sajnos az emissziós jelek vizsgálata még nem teszi lehetővé a cochlearis erősítés differenciáldiagnózisát. Nincs lehetőségünk például annak eldöntésére, hogy adott esetben mi tehető felelőssé a cochlea hibás működéséért. Nem tudjuk eldönteni, hogy a külső szőrsejtek sztereociliumainak és az őket fedő membrana tectoria elkülönülése okolható a hibáért vagy a külső szőrsejtek basolateralis membránjában található motormolekulák szerkezében létrejövő változás lehet a hiba forrása vagy esetleg valami teljesen más.
Annak érdekében, hogy kifejleszthessünk a cochlearis erősítés differenciáldiagnosztikáját szolgáló technikát, egy lézerinterferometriás módszert hoztunk létre, ami lehetőséget teremt a cochlea mechanikai bemeneti impedanciájának megmérésére. A módszer alkalmazása során a dobhártya rezgését követjük nyomon, és a berendezést "Lézeraudiométer"-nek neveztük el. A vizsgálat azon az elven nyugszik, hogy a cochlea bemeneti impedanciája a középfül impedancia terheléseként jelentkezik, vagyis a cochleában létrejövő mechanikai változások elméletileg nyomon követhetőek a dobhártya rezgésének tanulmányozásával. A vizsgálatokat lehetővé teendő, újraterveztük egy korábbi, a hallásküszöb körüli vibrációméréseket szolgáló készülékünket (Rodriguez Jorge és mtsai., 1997). Már sikerült bizonyítékot találnunk cochlearis eredetű komponensre a dobhártya rezgéseinek vizsgálata során. Jelenlegi kísérleteinket szenzorineurális eredetű halláskárosodásban szenvedő betegek felbecsülhetetlen értékű segítségével végezzük.
A külső szőrsejtek, ugyanúgy mint más polarizált sejtféleségek, rendelkeznek egy tubulosokból és vesiculumokból felépülő endoplasmás reticulummal. Ez a struktúra számos specifikus funkciót szolgál, pl. fehérjeszintézis, kalciumtárolás, szteroidok szintézise és glikogénprodukció és tárolás. Úgy tűnik, hogy a külső szőrsejt az egyik legösszetettebb ilyen hálózattal rendelkező sejt. A laterális ciszternák, amik a külső szőrsejtek endoplasmaticus reticulumának integráns részét képezik, szintén fontos szerepet játszanak a sejtben végbemenő membrán le- és felépítésében. Ismert, hogy a szőrsejtek mind az apicalis (endocitózis), mind a szinaptikus (exocitózis) pólusuknál egyaránt rendelkeznek endocitotikus aktivitással. Nem világos azonban a membrán recirkulációjának, és ezen belül is az endocitózisnak a sejt működésében betöltött pontos szerepe.
Munkacsoportunk a membrán újraépülésének mechanizmusát vizsgálja. Az külső szőrsejtek vesikulum-transzportját különböző fluorescens festékek, pl. FM 1-43 (egy membránmarker), DiOC6 (az endoplasmaticus reticulum markere) és „neutral red” (lizoszóma-marker) segítségével tanulmányozzuk. A fluorescens jelet kettős-foton konfokális mikroszkópia segítségével tanulmányozzuk. Az FM 1-43 festék reverzibilisen kötődik a membránhoz, az endocitózist követően a vesiculomokba zárt festék jól látható. Kimutattuk, hogy a külső szőrsejtek apicalis felszínén endocitózis történik, és az intracelluláris térbe jutó membrándarabok az infrakutikuláris területre, a felszíni membrán alatt elhelyezkedő ciszternákba és a szinaptikus régióba vándorolnak (Meyer és mtsai. 2001). A jelenleg folyó kutatások célja a külső szőrsejtekben folyó intracelluláris vesiculum-transzport szabályozómechanizmusainak feltérképezése.
A matematikai modellezés során a kísérletekből származó információkat építjük be a cochlea hangfeldolgozását leíró modellekbe, annak érdekében, hogy jobban megérthessük annak működését és új diagnosztikai eszközöket fejleszthessünk ki.
A Corti-szerv egy modelljét Charles Steele (University of Standford) segítségével közösen fejlesztjük. A modell alkalmazása a kísérletek során kapott (Scherer és Gummer, 2004a) mechanikai impedancia értékeknek megfelelő adatokat eredményez. Másfelől, a modell magyarázattal szolgál arra a kísérleti eredményre, miszerint az impedancia tisztán viszkoelasztikus és nem tartalmaz tehetetlenségi komponenst. Azon dolgozunk, hogy a modellt beépítsük a cochlea működését leíró általános modellbe.
Diagnosztikai vizsgálatainkat Renato Nobili professzorral (University of Padua) együttműködve végezzük, amelynek során az otoakusztikus emisszió eredetét kutatjuk. Ezeket az akusztikus jeleket, amelyeket néha akusztikus stimuláció nélkül is rögzíthetünk (spontán emisszió), akusztikus stimulációval (akusztikusan kiváltott emisszió) vagy elektromos jellel (elektromosan kiváltott emisszió) is kiválthatunk, az egészséges cochlea produkálja. Ezek a jelek a külső szőrsejtek elektromechanikus működésének a melléktermékei. Az akusztikusan kiváltott otoakusztikus emisszió vizsgálata objektív jelzője a cochlearis erősítés megfelelő működésének, így ez az eljárás különös jelentőséggel bír az újszülöttek vizsgálatában. Az emissziót kiváltó mechanizmusok még nem teljesen ismertek, így optimális stimulációs protokol még nem létezik. Jelenlegi munkánk a fenti problémákat kívánja megoldani.
A külső szőrsejt receptoráramának mérése
Kettős-foton konfokális mikroszkóp
A külső szőrsejt által
kifejtett erő mérése
Mechanikai impedancia mérése
A Corti-szerv vibrációjának mérése
Lézeraudiometria
Külső szőrsejt kettős
jelölése
A cochlea hidrodinamikai modelljének térbeli
ábrázolása